Метод иммуноферментного анализа в диагностике

Во всех областях медицины в современных условиях для диагностики и научных целей используется иммунный анализ, в основу которого положена реакция взаимодействия антигена и антитела с использованием различных вариантов мечения одного из компонентов (фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель и другие). Методы иммунного анализа, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммунный (РИА) и иммунофлуоресцентный отличаются между собой по типу используемой метки, условиям и вариантам методик.

Иммуноферментный анализ широко используется для диагностики в биологии и медицине как практической, так и фундаментальной. Отдельные варианты твердофазного ИФА позволяют выявлять в образце единичные молекулы.

Метод ИФА — лабораторный метод, который используется для качественного или количественного определения веществ в низких и очень низкий концентрациях. Данный метод позволяет идентифицировать такие биологически активные вещества организма человека как: гормоны, ферменты, нейропептиды, продукты иммунной системы и другие, а также предназначен для выявления чужеродных антигенов и антител. Биогенные амины: melatonin, adrenaline, noradrenaline, dopamine, metanephrine, normetanephrine, serotonin, tryptophan - определяют в сыворотке крови, плазме, моче, а histamine представляется возможным определить и в кале.

Метод ИФА имеет ряд преимуществ: метод высокочувствителен, специфичен, точен, экспресс-метод, стандартизован (оценка реакции проводится автоматически), не требует специальных условий в лаборатории, для работы необходимы микрообъемы материала, выполняется методика на доступном отечественном или импортном оборудования.

Иммуноферментный анализ основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результате реакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт. С помощью ридера или иммуноферментного анализатора спектрофотометрически определяется искомое в материале соединение или вещество.

Постоянное техническое совершенствование методики привело к появлению возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности. В современных иммуноферментных наборах широко используют моноклональные антитела. Необычайно широкий круг задач, стоящих перед исследователями по разработке новых тест-систем для определения биологически активных веществ (БАВ) послужил дальнейшему развитию метода, повышению его чувствительности и специфичности.

Теоретическая основа иммуноферментного анализа сформирована на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии.

Чувствительность метода ИФА и время проведения методики определяется кинетическими и термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью метода его детекции.

Объектами исследования ИФА являются как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные соединения, вирусы и бактерии.

При проведении ИФА для предупреждения внелабораторных ошибок необходимо:

• соблюдение условий сбора и подготовки проб;
• соблюдение условий хранения проб;
• соблюдение условий транспортировки и хранения тест-систем;
• проведение входного контроля тест-систем: определение качества тест-систем (чувствительность,
  специфичность, воспроизводи-мость с помощью контрольных материалов);
• предупреждение перекрестных реакций.

При проведении ИФА для предупреждения внутрилабораторных ошибок необходимо выполнение следующих мероприятий:

• соблюдать правил безопасности в диагностической лаборатории;
• оформлять соответствующую документацию;
• осуществлять контроль за соблюдением или выполнением инструкции по применению тест-системы,
  вложенной непосредственно в комплект к используемому набору реагентов;
• исключить ошибки при подготовке тест-систем и проб к анализу, а именно: не смешивать реагенты
  разных серий, контролировать качество и чистоту лабораторной посуды, наконечников к
  микропипеткам и дозаторам, контролировать температуру реагентов, исключить ошибки на этапе
  учета результатов;
• контроль работы оборудования;
• оценка качества работы лаборантов.

Основные рекомендации при подготовке проб крови к выполнению ИФА.

Инструменты и лабораторная посуда используемые для анализа должны быть чистыми и сухими. Для исследования чаще используется кровь полученная из локтевой вены у пациента (натощак). Забор крови у пациентов должен быть осуществлен иглами с большим диаметром, чтобы избежать повреждения эритроцитов, так как гемолиз эритроцитов ведет к ложноположительному результату. Кровь должна храниться не более 24 часов с момента забора и при температуре +2º...+8ºС. Сыворотку крови следует отбирать после отстаивания крови в термостате при 37°С в течение не менее чем 1 час. Сыворотка крови может быть отделена от эритроцитов центрифугированием (10 мин. при 3000 об/мин или 20 мин. при 1500 об/мин). Хранить сыворотки следует при температуре +2º...+8ºС от 5 до 7 дней, так как более длительное хранение ведет к бактериальному проросту и ложноположительному результату. Для более длительного хранения сыворотки, допускается ее замораживание при – 20ºС и хранение сроком до 20 дней, так как при более длительном хранении процесс замораживания влияет на структуру и стабильность некоторых компонентов пробы. Не следует замораживать и размораживать сыворотки несколько раз, так как многократное размораживание приводит к разрушению антигенов и антител, изменению состава проб. Сыворотки крови не рекомендуется хранить в саморазмораживающемся холодильнике.

В методе иммуноферментного анализа выделяют 3 стадии:

1. «узнавание» тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию
иммунного комплекса;

2. формирование связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. превращение ферментной метки в регистрируемый сигнал.

В основу классификации ИФА положено несколько подходов:

I. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и
неконкурентный методы.

- конкурентный метод ИФА - на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое
соединение и его аналог, меченный ферментном, который конкурирует с анализируемым соединением
за центры специфического связывания с ним.

- неконкурентный метод ИФА - в системе на первой стадии присутствует только анализируемое
соединение и специфичные к нему центры связывания.

II. Методы ИФА делятся на гомогенные и гетерогенные.

Гомогенный метод.
Предполагает проведение трех стадий ИФА в растворе, где между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от компонентов, которые не прореагировали. Гомогенный метод предназначен для определения низкомолекулярных субстанций и в его основе лежит ингибирование активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело. Связывание антитела с антигеном (содержащим ферментную метку) приводит к ингибированию активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату. Это обусловлено исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат.

Экспресс-метод.
Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.

Гетерогенный метод.
Осуществляется проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от компонентов, которые не прореагировали (отмывка вошером), и находящихся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а не прореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами. Методы относятся к гомогенно - гетерогенным, если первая стадия ИФА – образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.

В методе ИФА по принципу определения тестируемого вещества выделяют:

1) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антител) по числу прореагировавших (провзаимодействовавших) с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе антиген-антитело. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.

2) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться. Наблюдается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.

В диагностике используют и применяют следующие варианты методики ИФА: с общим принципом ИФА, прямой иммуноферментный анализ, непрямой иммуноферментный анализ, по принципу «Сэндвич» - как вариант для выявления антигенов, конкурентный ИФА, ингибиторный ИФА, метод иммуноферментных пятен (ELISPOT) и другие.

Метод иммуноферментного анализа во многом уникален, что позволило ему получить широкое применение, как в диагностике, так и в исследованиях, проводимых в рамках научных проектов.