Метод імуноферментного аналізу в діагностиці

У всіх галузях медицини в сучасних умовах для діагностики та наукових цілей використовується імунний аналіз, в основу якого покладена реакція взаємодії антигену і антитіла з використанням різних варіантів мічення одного з компонентів (фермент, радіонуклід, флуоресцентний барвник та інші). Методи імунного аналізу, такі як імуноферментний аналіз (ІФА), хемілюмінесцентний аналіз і імунофлуоресцентний відрізняються між собою за типом використовуваної мітки, умовами і варіантами методик.

Імуноферментний аналіз широко використовується для діагностики в біології та медицині як практичній, так і у фундаментальній. Окремі варіанти твердофазного ІФА дозволяють виявляти у зразку поодинокі молекули.

Метод ІФА - лабораторний метод, який використовується для якісного або кількісного визначення речовин в низьких і дуже низьких концентраціях. Даний метод дозволяє ідентифікувати такі біологічно активні речовини організму людини як: гормони, ферменти, нейропептиди, продукти імунної системи та інші, а також призначений для виявлення чужорідних антигенів та антитіл. Біогенні аміни: melatonin, adrenaline, noradrenaline, dopamine, metanephrine, normetanephrine, serotonin, tryptophan - визначають у сироватці крові, плазмі, сечі, а histamine можливо визначити і в калі.

Метод ІФА має ряд переваг: метод високочутливий, специфічний, точний, експрес-метод, стандартизований (оцінка реакції проводиться автоматично), не вимагає спеціальних умов у лабораторії, для роботи необхідні мікрообсяги матеріалу, виконують методику на доступному вітчизняному або імпортному обладнанні.

Імуноферментний аналіз заснований на специфічному зв'язуванні антитіла з антигеном, при цьому один з компонентів кон'югованих з ферментом, в результаті реакції з відповідним хромогенним субстратом утворюється забарвлений продукт. За допомогою рідера або імуноферментного аналізатора спектрофотометрично визначається шукане в матеріалі з'єднання або речовина.

Постійне технічне вдосконалення методики призвело до появи можливості іммобілізації антигену і антитіла на різних носіях із збереженням їх зв'язуючої активності. У сучасних імуноферментних наборах широко використовують моноклональні антитіла. Надзвичайно широке коло завдань, що стоять перед дослідниками з розробки нових тест-систем для визначення біологічно активних речовин (БАР) послужило подальшому розвитку методу, підвищенню його чутливості і специфічності.

Теоретична основа імуноферментного аналізу сформована на даних сучасної імунохімії та хімічної ензимології, знаннях фізико-хімічних закономірностей реакції антиген-антитіло, а також на головних принципах аналітичної хімії.

Чутливість методу ІФА і час проведення методики визначається кінетичними і термодинамічними характеристиками реакції антиген-антитіло, співвідношенням реагентів, активністю ферменту і роздільною здатністю методу його детекції.

Об'єктами дослідження ІФА є як низькомолекулярні, так і високомолекулярні сполуки, віруси і бактерії.

При проведенні ІФА для попередження нелабораторних помилок необхідно:

• дотримання умов збору та підготовки проб;
• дотримання умов зберігання проб;
• дотримання умов транспортування та зберігання тест-систем;
• проведення вхідного контролю тест-систем: визначення якості тест-систем (чутливість,
  специфічність, відтворюваність за допомогою контрольних матеріалів),
• попередження перехресних реакцій.

При проведенні ІФА для попередження внутрішньолабораторних помилок необхідно виконання наступних заходів:

- дотримуватися правил безпеки в діагностичній лабораторії;

- оформляти відповідну документацію;

- здійснювати контроль за дотриманням або виконанням інструкції із застосування тест-системи,
вкладеної безпосередньо в комплект до використовуваного набору реагентів;

- виключити помилки при підготовці тест-систем і проб до аналізу, а саме: не змішувати реагенти
ррізних серій, контролювати якість і чистоту лабораторного посуду, наконечників до
мікропіпеток і дозаторів, контролювати температуру реагентів, виключити помилки на етапі
обліку результатів.

- контроль роботи обладнання;

- оцінка якості роботи лаборантів.

Основні рекомендації при підготовці проб крові до виконання ІФА.

Інструменти і лабораторний посуд використовувані для аналізу повинні бути чистими і сухими. Для дослідження частіше використовується кров отримана з ліктьової вени у пацієнта (натщесердце). Забір крові у пацієнтів повинен бути здійснений голками з великим діаметром, щоб уникнути пошкодження еритроцитів, так як гемоліз еритроцитів веде до хибнопозитивного результату. Кров повинна зберігатися не більше 24 годин з моменту забору і при температурі +2?...+8?С. Сироватку крові слід відбирати після відстоювання крові в термостаті при 37 ° С протягом не менше ніж години. Сироватка крові може бути відокремлена від еритроцитів центрифугуванням (10 хв. При 3000 об / хв або 20 хв. При 1500 об / хв). Зберігати сироватки слід при температурі +2 ? ... +8 ? С від 5 до 7 днів, так як більш тривале зберігання веде до бактеріального проросту і хибнопозитивного результату. Для тривалішого зберігання сироватки, допускається її заморожування при - 20 ? С і зберігання терміном до 20 днів, тому що при більш тривалому зберіганні процес заморожування впливає на структуру і стабільність деяких компонентів проби. Не слід заморожувати і розморожувати сироватки кілька разів, так як багаторазове розморожування призводить до руйнування антигенів і антитіл, зміни складу проб. Сироватки крові не рекомендується зберігати у саморозморожуваному холодильнику.

У методі імуноферментного аналізу виділяють три стадії:

1. «упізнавання» тестованого з'єднання специфічним до нього антитілом, що веде до утворення
імунного комплексу;

2. формування зв'язку кон'югату з імунним комплексом або з вільними місцями зв'язування;

3. перетворення ферментної мітки в реєстрований сигнал.

В основу класифікації ІФА покладено кілька підходів:

I. За типом реагентів, присутніх на першій стадії ІФА, розрізняють конкурентний і
неконкурентний методи.

- конкурентний метод ІФА - на першій стадії в системі присутні одночасно аналізоване
з'єднання і його аналог, мічений ферментному, який конкурує з аналізованим з'єднанням
за центри специфічного зв'язування з ним.

- неконкурентний метод ІФА - в системі на першій стадії присутнє тільки аналізоване
з'єднання і специфічні до нього центри зв'язування.

II. Методи ІФА поділяються на гомогенні і гетерогенні.

Гомогенний метод.
Передбачає проведення трьох стадій ІФА у розчині, де між основними стадіями немає додаткових етапів поділу утворених імунних комплексів від компонентів, що не прореагували. Гомогенний метод призначений для визначення низькомолекулярних субстанцій і в його основі лежить інгібування активності ферменту при його з'єднанні з антигеном або антитілом. Активність ферменту відновлюється в результаті реакції антиген-антитіло. Зв'язування антитіла з антигеном (що містить ферментну мітку) призводить до інгібування активності ферменту на 95% по відношенню до високомолекулярного субстрату. Це обумовлено винятком субстрату з активного центру ферменту. У міру збільшення концентрації антигену зв'язується все більше антитіл і зберігається все більше вільних кон'югатів антиген-фермент, здатних гідролізувати високомолекулярний субстрат.

Експрес-метод.
Чутливість методу досить висока. З його допомогою можна визначити речовину на рівні пікомоль.

Гетерогенний метод.
Здійснюється проведення аналізу у двофазній системі за участю твердої фази - носія, і обов'язкова стадія поділу імунних комплексів від компонентів, що не прореагували (відмивання вошером), і знаходяться вони у різних фазах (утворені імунні комплекси знаходяться на твердій фазі, а не прореаговані комплекси - у розчині). Гетерогенні методи, в яких формування імунних комплексів на першій стадії протікає на твердій фазі, називають твердофазними методами. Методи відносяться до гомогенно - гетерогенним, якщо перша стадія ІФА - утворення специфічних комплексів відбувається у розчині, а потім для розділення компонентів використовують тверду фазу з іммобілізованим реагентом.

У методі ІФА за принципом визначення тестованої речовини виділяють:

1) Пряме визначення концентрації речовини (антигену або антитіл) за кількістю прореагувавших (провзаємодіяних) з ним центрів зв'язування. У цьому випадку ферментна мітка буде знаходитися в утвореному специфічному комплексі антиген-антитіло. Концентрація визначеної речовини буде прямо пропорційна реєстрованим сигналам.

2) Визначення концентрації речовини по різниці загального числа місць зв'язування і залишених вільних центрів зв'язування. Концентрація визначеної речовини при цьому буде зростати, а реєстрований сигнал знижуватися. Спостерігається зворотна залежність від величини реєстрованого сигналу.

У діагностиці використовують і застосовують такі варіанти методики ІФА: з загальним принципом ІФА, прямий імуноферментний аналіз, непрямий імуноферментний аналіз, за принципом «Сендвіч» - як варіант для виявлення антигенів, конкурентний ІФА, інгібіторний ІФА, метод імуноферментних плям (ELISPOT) та інші.

Метод імуноферментного аналізу багато в чому унікальний, що дозволило йому отримати широке застосування, як в діагностиці, так і в дослідженнях, проведених в рамках наукових проектів.